褐藻寡糖是褐藻膠通過一定的裂解反應得到的功能性寡糖，具有豐富多樣的生物活性，如抗腫瘤、抗炎、免疫調節及降血脂等作用，在醫藥、保健品、化妝品、動物飼料及植物調節劑等領域具有很強的應用前景。褐藻寡糖的傳統制備方式是利用堿液對富含褐藻膠的大型褐藻進行降解，該方法會破壞褐藻中活性成分，同時造成很大的環境污染。而且堿解技術制備的褐藻寡糖、聚合度不穩定，隨之帶來的就是效果不穩定。

2017年12月，漢和生物與中科院天津工生所合作開發褐藻膠裂解酶及制備褐藻寡糖的研發項目，通過研究，挖掘表征了一個新型耐堿性的雙功能褐藻膠裂解酶，對褐藻膠中的多聚甘露糖醛酸(polyM)和多聚古洛糖醛酸(polyG)均具有較高活性，能夠徹底降解褐藻膠，主產物為褐藻二糖、三糖和四糖，并進一步通過蛋白結構域改造，顯著提高了該酶的酶活及熱穩定性，使該酶具備較強工業化應用潛力。

今天，筆者將從如何篩選產褐藻膠裂解酶的菌株、酶基因的篩選轉化及工程菌構建、發酵工藝優化、酶解制備褐藻寡糖工藝的優化方面為大家一一揭秘。

一、篩選產褐藻膠裂解酶的微生物

褐藻膠裂解酶主要來源于海洋藻類、海洋軟體動物、棘皮動物等體內和多種微生物，我們篩選了來自海洋和陸地細菌，軟體動物和藻類植物的各種褐藻膠裂解酶，鑒定出100多種產褐藻膠裂解酶的菌，再通過對產酶菌株進行篩選，選出產褐藻膠裂解酶酶活性最高的一株進行進一步的分析。

?褐藻膠裂解酶活性初篩，透明圈越大，活性越強

二、褐藻膠裂解酶基因篩選，構造基因工程菌

將篩選出的高活性菌株，進行基因組測序，通過研究酶翻譯及轉運加工機制，形成一套分子伴侶及蛋白酶介導的分子組件，建立多結構域褐藻膠裂解酶自組裝成熟蛋白的控制系統，開發具有特異性強、水解效率高、分子量與結構可控的褐藻寡糖高效制備工具酶——褐藻膠裂解酶，并通過將篩選到的褐藻膠裂解酶基因連接表達載體（質粒DNA），構建重組表達質粒，轉化枯草芽孢桿菌宿主細胞，篩選陽性克隆，即為構建的產褐藻膠裂解酶基因工程菌。

三、優化褐藻膠裂解酶發酵工藝，提高酶活。

   褐藻膠裂解酶與其它同類酶相比，酶活是現有sigma試劑型褐藻膠裂解酶40倍以上。具有15% NaCl的高耐鹽性、4℃保存一年酶活無損失的超穩性及靶向剪切的底物專一性等特點。漢和生物通過建立枯草芽孢桿菌發酵酶制備技術（基因工程菌發酵技術），酶活高達40000 U/mL以上，已優化達到科技部查新認證全球最高水平。

?左邊是沒有菌的海帶；右邊是加菌培養后的海帶，高活性褐藻膠裂解酶已經把海帶降解成渣。

?2L四聯發酵罐

相比其他菌發酵，枯草芽孢桿菌生長速度快、發酵產酶周期短且為分泌表達，酶后處理工藝簡單，而大腸桿菌發酵產酶需要破碎、操作復雜，畢赤酵母產酶發酵周期長，成本高昂。   

四、褐藻膠裂解酶酶解海藻多糖（海藻酸及海藻酸鹽）制取褐藻寡糖

目前，市場上褐藻寡糖制備工藝多采用化學法，此方法反應條件不易控制、功能活性差、產物回收率低、環境不友好。漢和生物聯合中科院天津工生所，采用褐藻膠裂解酶裂解海藻酸制備褐藻寡糖，主產物為褐藻二糖、三糖和四糖，聚合度穩定，活性高。

? A表示褐藻膠裂解酶酶解后產物褐藻寡糖時程分析；B表示褐藻寡糖的相對含量

褐藻膠裂解酶酶解制取的褐藻寡糖，反應速度快、條件溫和，酶解周期短。褐藻寡糖聚合度可控制在2-4聚占比75%以上，分子量集中在414-810，與強酸堿（pH:3-10)、鈣、鎂復配，高溫150℃以上，無絮凝、沉淀，添加成本低，活性高。

五、褐藻寡糖的功效

 1、激活SA（水楊酸）、JA（茉莉酸）免疫系統，可抗細菌、病毒侵害，減少農藥使用。

2、誘導植物合成ABA（脫落酸含量提高5倍）、JA（茉莉酸），增強植物抗逆性，著色增甜，早成熟、早上市。

3、誘導植物合成IAA（生長素含量提高8倍），快速生根發芽，長勢快。

4、添加褐藻寡糖，產品具有植物疫苗功效。

褐藻寡糖（AOS）被證明是植物體內重要的信號分子，可促進植物的生長，提高植物對病害的抵抗力，增強植物對環境的適應能力，提高作物產量和品質。也是促進人內皮細胞和角質形成細胞生長的雙歧因子，它具有特殊的生物活性，例如抗腫瘤，抗炎，抗凝，抗氧化，免疫調節以及降低血脂和血糖的作用，因此可用于藥物和健康食品。

?左圖為以褐藻寡糖為核心成分的藥品，右圖為題為：褐藻寡糖在生長素信號轉導下對水稻根系發育的促進作用的研究論文。